日本血吸虫重组SjTsp2Sj29kDa表膜蛋白疫苗

时间:2021-10-01 00:55 作者:鸭脖官网进入
本文摘要:1血吸虫病阐述 血吸虫病(schistosomiasis)是所指由血吸虫(Schistosome)病毒感染引发的一种产于普遍、严重危害的人类的寄生虫病。在全球风行的传染病中,血吸虫病归属于更为相当严重的。传播环节简单,风行因素较多,并易受季节的影响,高危人群较集中于以及居民的生产生活方式等造成了血吸虫病的预防可玩性较高。 目前在亚洲、非洲和南美洲的76个国家风行,有6亿人受到威胁,2亿人不受病毒感染,全世界每年大约有数十万人杀于该病[1]。

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1血吸虫病阐述   血吸虫病(schistosomiasis)是所指由血吸虫(Schistosome)病毒感染引发的一种产于普遍、严重危害的人类的寄生虫病。在全球风行的传染病中,血吸虫病归属于更为相当严重的。传播环节简单,风行因素较多,并易受季节的影响,高危人群较集中于以及居民的生产生活方式等造成了血吸虫病的预防可玩性较高。

目前在亚洲、非洲和南美洲的76个国家风行,有6亿人受到威胁,2亿人不受病毒感染,全世界每年大约有数十万人杀于该病[1]。根据2011年全国血吸虫病疫情通报,我国另有454个血吸虫病风行县(市、区),共计31303个风行村,估算患者28万余例,全国现有钉螺面积372664.10hm2,其中新发现钉螺面积1163.87hm2[2]。可见,血吸虫病的预防依然是我国疾病防治的重中之重。

   灭亡螺和吡喹酮的用于是目前预防血吸虫病主要措施,吡喹酮是现今唯一有效地的化疗药物,但它虽能减少感染率和发病率,却无法切断血吸虫的传播途径,对早已引起的肝脾伤害没显著的起到,感染者经药物化疗后再度认识疫水仍不会再次发生反复病毒感染。另有文献资料表明,药物的长年用于可能会引发血吸虫潜在抗药性。

因此,研制一种安全性、有效地且可持续免疫系统维护效果的抗血吸虫病疫苗不利于长年掌控血吸虫病以及提升化学疗法的效果[3-4]。   2血吸虫病疫苗的研究   血吸虫病疫苗是血吸虫病预防措施的一个最重要补足,它的研究有数80多年的历史,经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程重组疫苗、外用独特性抗体疫苗、DNA疫苗、填充肽疫苗、载体与佐剂的应用于等几个阶段,目前研究主要集中于在蛋白质疫苗、DNA疫苗和血吸虫联合疫苗等几个方面[1]。

2.1蛋白质疫苗   蛋白质疫苗是血吸虫病疫苗主要类型之一,其种类较多,重组蛋白疫苗是其中的一种,重组蛋白疫苗是将具备保护性的抗原分子的基因(或抗原决定簇基因片段)放入载体(如质粒)中,将重组分子引入不受体细胞(如大肠杆菌)中展开传达,后用蛋白质提纯技术将传达的目的蛋白更进一步分离出来提纯,提纯后的蛋白通过佐剂乳化后做成疫苗,展开免疫系统[5]。   目前为止,重组抗原的研究主要处在血吸虫尾蚴、童虫、成虫和虫卵等几个阶段[6]。其候选抗原分子有副肌球蛋白、谷光甘肽转移酶(GST)、磷酸丙酮异构酶、太阳光减毒抗原5(Irv-5)、原始膜蛋白(Sm23)和脂肪酸融合蛋白(Sm14)、信号蛋白14-3-3、重组蛋白和表位肽、钙离子转录蛋白激酶、磷酸甘油醛脱氢酶等,其中前6种被世界卫生组织热带病尤其规划署(WHO/TDR)确认为重组血吸虫病疫苗候选分子[7]。现将各个候选分子的研究进展分述如下:⑴谷胱甘肽-S-转移酶(GST)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是一组同工酶,其联合底物为谷胱甘肽   血吸虫所含非常丰富的GST,不存在于成虫的实质的组织实质细胞内。

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白经基因工程技术传达,性刺激人体免疫系统产生反感的、T细胞倚赖的、针对性很强的免疫反应;同时还能显著诱导外用尾蚴的反击病毒感染和外用生殖的保护性免疫反应[8]。曾有研究用含重组谷胱甘肽-S-转移酶基因的抗原免疫系统水牛,能诱导机体产生保护性免疫反应,防治血吸虫尾蚴病毒感染,还能诱导宿主体内雌虫的繁殖。实验动物体内成虫数、虫卵数皆有显著的增加,对于肝的组织肉芽肿恶性肿瘤也有显著的减低,另外粪便中虫卵的孵化率减少大约400%[9]。   ⑵磷酸丙糖异构酶(TPI)   磷酸丙糖异构酶(TPI)比较分子质量大约为28000,在血吸虫各个阶段细胞里完全都有TPI的不存在,它可以催化剂糖酵解(EMP)途径中磷酸二羟丙酮(DHAP)与3-磷酸甘油醛(GAP)可逆反应,它是血吸虫生命新陈代谢活动的最重要功能分子之一,催化剂磷酸二轻丙酮分子和磷酸甘油醛之间的可逆反应,是参予血吸虫糖代谢过程的一个关键酶[10]。

   ⑶副肌球蛋白(paramyosin)抗原   副肌球蛋白是一种肌原纤维蛋白,分子量为97kD,主要坐落于血吸虫肌的组织内,尾蚴的排便盘腺体内也不存在这种蛋白。该蛋白质不仅参予虫体本身肌纤维功能,还能与动物和人的抗体Fc片段融合,诱导补体细胞内的免疫反应。

在虫体发育过程中副肌球蛋白抗原不会融合到虫体表面,虫体在脊柱时该蛋白即沦为靶抗原诱导产生保护性免疫,在人外用血吸虫病毒感染的免疫系统过程中该蛋白主要引发IgA免疫系统接收者。以往研究指出,副肌球蛋白能性刺激小鼠引发免疫反应,产生IFN-γ,并活化巨噬细胞,对侵略童虫具备杀伤力[11]。   ⑷太阳光减毒抗原5(Irv-5)   科研人员曾找到电磁辐射减毒曼氏血吸虫尾蚴后免疫系统动物,能取得较高水平的免疫系统维护效果,单次免疫系统保护率约50-70%,加强免疫后高达80-90%。

大量实验使用免疫系统血清学分析,最后找到了5种童虫和7种成虫糖蛋白抗原,其中就还包括太阳光减毒抗原5(Irv-5),在用重组的SjIrv-5做到抗原的免疫系统动物实验中,获得60-80%的免疫系统保护率[12],并被证实其再次发生的免疫系统机制与Th2引发的免疫反应涉及[13]。   ⑸膜涉及抗原(Sm23)   23kDa膜蛋白,比较分子质量为23000,它是膜蛋白超家族TM4SF的成员之一。不存在于血吸虫尾蚴、童虫及成虫中。

Sj23与人的多种表面蛋白具备高度同源性,在血吸虫生长和发育的过程中起着最重要的起到。Sm23本身具备T细胞和B细胞两种表位,它有很高的免疫原性主要归咎于分子外部的两个亲水区[14]。

林矫矫等应用于PCR技术首先编码克隆日本血吸虫(中国大陆株)23kD抗原的大亲水区多肽的DNA片段即LHD-Sj23,建构重组LHD-Sj23/pGEX抗原,并将该重组抗原免疫系统小鼠与绵羊,获得的减虫和减卵亲率都在50%以上,显露出了该重组抗原具备较高的免疫系统维护起到[15]   ⑹Mr14000的脂肪酸融合蛋白(FABP)   Gobert[16]等人展开免疫定位日本血吸虫脂肪酸融合蛋白,首次找到SjFABP主要不存在于雌虫皮下脂质小滴内及雌虫卵黄腺内的卵黄小滴内。Becke等[17]通过大量的实验得出结论脂肪酸融合蛋白是外用血吸虫起到的最重要靶标,因为血吸虫自身无法制备脂肪酸及固醇类物质,必需倚赖宿主获取。脂肪酸融合蛋白的起到是吸取、运输和毁灭宿主体内各种派生的脂肪酸,所以在血吸虫脂代谢过程中FABP起着最重要起到,依循该蛋白可以作为药物靶蛋白,也可以作为疫苗的候选分子。但是该蛋白在各种动物实验中取得的减虫率并不完全一致,其免疫系统维护效果尚待更进一步研究[18]。

   ⑺硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(TGR)   血吸虫成虫必需生活在一个有氧的环境中,它可以保持自身的水解还原成均衡。同时血吸虫依赖谷肤甘肤和硫氧还蛋白两个系统以逃离宿主免疫系统的活性氧的损害[19]。

曾有实验得出结论,硫氧还蛋白可以传达于血吸虫的发育和交配阶段,并且虫卵黏液产物中所含硫氧还蛋白同时又经常出现在抗融合蛋白产生的环沉淀素反应的抗体中。另外还有学者找到硫氧还蛋白是一种特异性的虫卵抗原,诱导病毒感染血吸虫的小鼠产生特异性的IgG抗体。

以上结果证明硫氧还蛋白与血吸虫存活相关联,它可以杯葛宿主的炎性反应对虫卵的损害[20]。   ⑻四跨膜蛋白超家族(TM4SF)   四跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily,TM4SF)多种的组织、细胞的膜构成成分,其分子量仅有在20-50kDa之间,归属于分子量较小的糖蛋白,它还包括20多个成员[21]。该家族的最重要成员Tetraspanins是一种细胞膜蛋白,传达于多个物种中,归属于细胞膜糖蛋白中类似家族[22]。

血吸虫体被外表膜有多种四跨膜蛋白[23]。Tran,M.H.等[24]通过信号序列捕捉技术找到了两个TSP家族成员—SmTsp1和SmTsp2,实验研究得出结论其中的SmTSP2融合蛋白免疫系统小鼠后,减虫率57%、肝脏减卵亲率64%和粪减卵亲率69%。

在曼氏血吸虫病动物实验中,用重组蛋白rSmTSP2做到抗原免疫系统小鼠,取得减虫率57%和肝脏减卵亲率64%[25]。而日本血吸虫体被传达的TSP2蛋白作为抗原诱导的免疫系统维护效果并不平稳。有实验室将SjTSP2扩充了膜外大环区,亚克隆至pET32a质粒中传达了Trx-TSP2融合蛋白,免疫系统动物后取得56%的减虫率、53%的肝脏减卵亲率以及52%的粪减卵亲率[26]。

   ⑼Sm29   Cardoso等[27]找到不受病毒感染人群血液中国经常出现较高水平的抗Sm29的IgG1和IgG3,其后通过大量实验和生物信息学确认Sm29蛋白是曼氏血吸虫低传达的跨膜分子。通过动物实验,用重组的Sm29蛋白免疫系统小鼠取得51%减虫率、60%减半卵率和50%减半肉芽肿,表明Sm29蛋白具备较好的免疫系统维护效果。蛋白序列同源性分析找到Sm29与日本血吸虫一些蛋白有较高的相似性,分别是:37%(SJCHGC02532),49%(SJCHGC05578),52%(SJCHGC05668)和53%(SJCHGC03008)[28]。这为研究日本血吸虫病疫苗候选分子获取了很有价值的参照。

2.2DNA疫苗   DNA疫苗又称核酸疫苗,即把外源基因克隆到真核质粒传达载体上,然后将重组的质粒DNA静脉注射到动物体内,体内传达并诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫反应,从而超过防卫疾病的目的[29]。1990年Wolff等[30]首次报导了DNA疫苗的研究成果。1995年Yang等[31]首次明确提出了用编码血吸虫候选疫苗Sj97即日本血吸虫副肌球蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)Sj26全长的cDNA片段建构DNA疫苗。

随后涉及DNA疫苗的研究工作迅速开展一起,DNA疫苗的研究沦为血吸虫病疫苗研究的主流方向。迄今为止日本血吸虫DNA疫苗还有SjTPI、Sj22.6、Sj23、Sj28-GST、SjHGPRT和SjSDISP等,这些DNA疫苗可诱导宿主产生较高水平的特异性抗体取得一定的维护效果[7]。与传统疫苗比起,DNA疫苗具备高效、长久、广谱、简单和廉价等优点,将有所不同病原体的DNA序列克隆到适合的载体中,通过诱导传达后输出机体,可起着强化免疫系统效果的起到[32]。   核酸疫苗接种后有可能在以下两个方面发挥作用:一方面是DNA转至皮肤后,可造成抗原托呈圆形细胞(APC)的转录,进而摄入和传达抗原或拒绝接受周边其他细胞成分传送的抗原,接着转交T细胞(Th)和细胞毒性T细胞;另一方面是DNA转至肌细胞后,在肌细胞内传达或其丧生后获释转入细胞间质,被免疫细胞主要是APC摄入并传达抗原,再行并转赠送给Th和CTL,肌细胞本身也可必要移往或送达抗原[33]。

然而由于宿主唤起外用血吸虫免疫系统的不完全性,血吸虫基因的复杂性以及生物长年演化过程中产生的免疫系统躲避等功能,使得单一抗原分子诱导宿主产生的免疫系统维护力往往不尽人意[34]。另外DNA疫苗本身还不存在一些问题,如:疫苗性刺激人体产生的免疫反应较大自然蛋白的免疫反应很弱;低水平传达及因此而造成机体的免疫耐受;外源DNA的放入否不会转录原癌基因还尚不定论[35]。为了提高疫苗的效果,研究趋向于自由选择用多个有所不同表位的抗原人组,协同作用,以期获得较好的免疫系统维护力[36]。因此牵头多种日本血吸虫病疫苗候选分子将沦为众多学者们注目的焦点。

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2.3血吸虫病联合疫苗   随着生物技术的发展以及免疫系统方法和途径的不断创新过程中,强化血吸虫病疫苗免疫系统维护起到的稳定性和高效性是研究血吸虫病疫苗重中之重。曾有报导称之为牵头DNA疫苗和蛋白疫苗已用作疟疾、结核病、AIDS等疾病的疫苗研究中,并且起着了强化疫苗维护效果的起到[37-39]。

这种途径可以充分发挥两种疫苗在宿主体内诱导免疫系统接收者的有所不同优势,从而强化疫苗诱导机体产生特异性免疫系统接收者的效果。目前血吸虫混合疫苗中有蛋白(重组蛋白和表位肽)的混合疫苗,DNA的混合疫苗,蛋白与DNA的混合疫苗[6]。鸡尾酒式DNA混合疫苗是联合疫苗的一种方式,将要多种传达有所不同表位抗原的基因重组疫苗非常简单的混合到一起所做成的一种混合疫苗,是提升日本血吸虫单一核酸疫苗的免疫系统维护效果的最简单的方法。

主要还包括多种重组核酸疫苗混合、重组蛋白疫苗与DNA重组疫苗混合两种方式[40]。以往有研究解释,日本血吸虫鸡尾酒式DNA混合疫苗免疫系统小鼠后,其免疫系统效果较单一疫苗明显增强。胡媛等[41]用双价共表达疫苗Sj23/SjFABP与双价融合传达疫苗Sj23/SjFABP混合,免疫系统小鼠后取得的减虫率为58.97%。

余光明等[42]将Sj26GSTDNA疫苗与rSj26GST混合,研究其免疫系统维护效果,获得50.8%的减虫率。吴公平[43]使用SjRPS4基因与蛋白疫苗牵头免疫系统小鼠,取得减虫率49.70%。

刘秉春等[44]使用核酸疫苗与蛋白疫苗牵头免疫系统的方式,将DNA疫苗初免、蛋白疫苗强化的牵头免疫系统,获得减虫率(42.3%)和减卵亲率(59.6%),同时需要明显减低血吸虫虫卵对肝脏的病理伤害。从以上研究结果可以显现出,与单一的DNA疫苗相比较,鸡尾酒式DNA混合疫苗的免疫系统维护效果明显增强,其免疫系统机制有可能归咎于挑选的有所不同抗原诱导了有所不同的免疫反应,产生了细胞细胞内或抗体细胞内的免疫系统机制,从而超过较高的免疫系统维护效果。   加到佐剂的重组DNA联合疫苗也归属于血吸虫病联合疫苗,DNA疫苗的佐剂是新的血吸虫病疫苗研究热点[29]。佐剂是所指与抗原同时或预先应用于,能强化机体针对该抗原的免疫系统接收者能力,或转变免疫反应类型的物质。

DNA疫苗佐剂主要有免疫刺激DNA序列(ISS)、细胞因子、脂质体三大类,ISS主要通过性刺激单核/巨噬细胞产生细胞因子、性刺激B细胞的电子货币及产生抗体,从而强化DNA疫苗的免疫系统效应;细胞因子具备佐剂和免疫增强起到;脂质体则有可能是通过DNA-脂质体复合物较慢释放出来DNA,从而充分发挥长效、持续起到来强化免疫系统效应[45]。冯清等[46]在以天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂,探究其对DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj23增效起到的研究中得出结论减虫率和减卵亲率分别为64.3%和79.9%,较对照组免疫系统维护效果明显增强。鲁燕妮等[47]在探究植物多糖佐剂对血吸虫病疫苗的增效机理的研究中,使用从香菇中萃取的多糖作为佐剂展开动物实验,得出结论多糖佐剂实验组减虫率(70.8%)和减卵亲率(84.8%)明显增强。

以上实验结果表明,牵头必要的佐剂,可以强化DNA疫苗的免疫系统维护效果。   3血吸虫病疫苗研究面对的问题与未来发展长期以来,对于日本血吸虫病疫苗的研究,虽然人们早已找到了许多分子作为抗原候选分子,具备部分免疫系统维护效果,但至今仍并未取得一种需要有效地预防日本血吸虫病的疫苗,所以找寻可产生长年效用的血吸虫病疫苗,仍然是众多学者们努力奋斗的目标。

为了前进血吸虫病疫苗研究工作,世界卫生组织热带病研究培训尤其规划署(WHOSpecialProgrammeforResearchanTraininginTropicalDiseases,TDR)将血吸虫病疫苗研制置放血吸虫病预防研究的优先地位。在我国,日本血吸虫病基因工程疫苗项目已划入了国家863、973等高技术计划范畴。   然而在血吸虫病疫苗研究过程中还不存在着一些问题:   ⑴目前已被检验的抗原分子的免疫系统维护力不低。科学家们曾以小鼠为模型对6种血吸虫病疫苗候选分子展开评估,结果都没超过40%或者更高的预期维护力[48],所以在疫苗的研究中,如何提升疫苗的免疫系统维护效果是关键点之一。

   ⑵免疫系统躲避现象。血吸虫免疫系统躲避机制有可能减少疫苗诱导的维护力水平或宿主产生的保护性免疫接收者。日本血吸虫虫体表面不存在许多抗原分子,它往往不会融合宿主自身抗原,躲避宿主免疫系统的辨识。

另外,疫苗免疫系统维护力的维持力必须时间和大量实验来证明。   ⑶实验动物与人的免疫系统之间的差异。

截至目前血吸虫病疫苗研究正处于动物模型实验的阶段,实验动物产生的免疫系统机制与人体差异相当大,而疫苗本身对于动物的不良反应还尚能不具体,所以造成实验动物得出结论的结论很难几乎限于于人体。血吸虫病疫苗的研究任重而道远,有可能必须几代人的希望去逐步构建,过程很艰苦,但是科学家们不会竭尽全力。

近几年,科学家们有了一些新的思路:(1)对新型疫苗候选抗原的检验。HuWei等[49]针对日本血吸虫各种生活阶段的全基因组序列展开分析,取得了43707个传达序列标签(ESTs),共13131个基因种类。LiuFeng等[50]通过较为蛋白质组学和较为mRNA组学的方法,对日本血吸虫各发育阶段及卵壳、体被传达的蛋白展开较为分析、检验,取得3260个蛋白;(2)多表位、多价疫苗或混合用于有所不同抗原疫苗,能协同发挥作用,针对有所不同虫期的抗原杀菌虫体,从而有效地提升疫苗的免疫系统维护效果[52];(3)新的疫苗寄送技术,如新的佐剂、纳米材料、脂质体等,佐剂的用于在疫苗免疫系统的过程中起着增进和提升免疫系统维护效果的起到,因此,自由选择必要的佐剂是不利于疫苗效果的提升;(4)强化对宿主免疫系统机制的研究。通过研究充份理解宿主病毒感染血吸虫后所引发的免疫反应,将不利于找到更佳的抗日本血吸虫病疫苗。


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